Jurjen Schirm, Viroloog, Laboratorium voor Infectieziekten, Groningen
Petra Bos, medisch bioloog, Laboratorium voor Infectieziekten, Groningen
Pieter van Voorst Vader, Dermatovenereoloog, Afd. Dermatologie, Univ. Med. Centrum Groningen

Redactioneel commentaar: Trichomonas-diagnostiek anno 2005

Trichomoniasis is de meest voorkomende non-virale soa in de wereld. De klassieke detectietechnieken hiervoor zijn het directe preparaat en de kweek, meestal in combinatie. Volgens verschillende onderzoeken blijkt de nieuwere nucleïnezuur-amplificatietechniek PCR aanzienlijk gevoeliger dan de combinatie van microscopie en kweek. ‘Real Time PCR’ is behalve gevoeliger ook sneller en niet duurder. In een afzonderlijk redactioneel commentaar wordt de vraag gesteld wat de implicaties zijn van de beweringen van de auteurs voor de microbiologische laboratoria en voor de aanvragers van soa-diagnostiek.

Samenvatting
Bij 1.977 vrouwen en 92 mannen, allen verdacht van een infectie met Trichomonas vaginalis, is onderzoek hiernaar verricht met real-time PCR en met een direct preparaat in combinatie met kweek. Daarbij werd T. vaginalis aangetoond bij 37 vrouwen (prevalentie 1,9%) en één man (prevalentie 1,1%).
De gevoeligheid van de PCR was 100%, die van direct preparaat+kweek 71%. De specificiteit van de PCR was 99,9%. Een controle-PCR, bij 9 vrouwelijke patiënten, uitgevoerd twee weken na behandeling, was in 7/9 gevallen negatief, bij één patiënte pas na drie maanden (maandelijks getest). Bij zeven vrouwelijke patiënten met een PCR-positief vaginaal monster werd ook een urinemonster getest; allen waren positief.
Bij standaard soa-onderzoek kan de PCR op T. vaginalis gecombineerd worden met de PCR op Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae. Op deze manier werden 785 vrouwen en 537 mannen, zonder op T. vaginalis wijzende klinische symptomen, getest. Daarbij was 1% van de vrouwen en 0,2% van de mannen T. vaginalis PCR-positief.
Concluderend: een PCR test op T. vaginalis is véél gevoeliger dan de kweek en het directe preparaat. De kosten zijn niet hoger dan die van direct preparaat + kweek. Indicaties: fluorklachten bij de vrouw, onbegrepen non-specifieke urethritis bij de man, en daarnaast eventueel standaard bij vrouwen als onderdeel van het standaard soa-onderzoek.

Inleiding
Infecties met Trichomonas vaginalis zijn de meest voorkomende non-virale soa, met wereldwijd een geschat aantal van 173 miljoen nieuwe besmettingen per jaar1. De T. vaginalis parasiet is de belangrijkste veroorzaker van vaginitis, cervicitis of urethritis bij vrouwen. Bij mannen is de infectie vaak asymptomatisch, maar deze kán urethritis, prostatitis of epididymitis veroorzaken.
De klassieke methoden voor het aantonen van T. vaginalis zijn het directe preparaat (‘wet mount’) en de kweek, die veelal in combinatie worden ingezet. Al in 1998 werd echter gepubliceerd dat een nucleïnezuuramplificatietechniek (PCR) op T. vaginalis veel gevoeliger is dan de kweek (97% versus 70%) en dat de kweek veel gevoeliger is dan het directe preparaat (36%).1 Dit werd later door verschillende laboratoria bevestigd.2,3,4 Naast de vrij lage gevoeligheid heeft de kweek ook nog het nadeel dat de test 3-5 dagen duurt.

Volgens de recente CBO-richtlijnen is de PCR de optimale diagnostische methode voor het aantonen van T. vaginalis.5 Niettemin is deze methode tot dusver slechts op weinig laboratoria beschikbaar, ondermeer door de hoge kosten. Op ons laboratorium is daarom recent een nieuwe – veel goedkopere - zogenoemde real-time PCR voor het aantonen van T. vaginalis opgezet. Real-time PCR is een moderne PCR-variant waarbij amplificatie van een specifiek gen (van T. vaginalis in dit geval) èn de specifieke detectie van het amplificatieproduct in één stap plaats vindt. Daardoor is de test veel sneller (ongeveer 4 uur) en bovendien minder vatbaar voor foutpositieve resultaten.

Methoden
Patiënten
Van 1.977 vrouwen en 92 mannen, allen verdacht van een T. vaginalis infectie (maar verder niet geselecteerd), werden genitale uitstrijken onderzocht op de aanwezigheid van T. vaginalis met zowel PCR als met direct preparaat en kweek.Het materiaal voor het PCR-onderzoek werd naar het laboratorium verstuurd in 2-SP medium, wat ook gebruikt wordt voor PCR-onderzoek op Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae.. Voor preparaat en kweek werd koolstof-transportmedium gebruikt.

Klassieke detectie
Bij aankomst op het laboratorium werd onmiddellijk een direct preparaat onderzocht, waarna bij een negatief resultaat kweken op selectief medium werden ingezet, die na 3 en 5 dagen eveneens werden onderzocht met een direct preparaat.

T. vaginalis PCR
Extractie van het DNA werd uitgevoerd met behulp van de Roche Specimen Ct/Ng Preparation kit. Daardoor is het mogelijk uit het zelfde extract desgewenst tevens PCR-onderzoek op C. trachomatis en/of N. gonorrhoeae uit te voeren. De real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van de ABI Prism 7700 thermocycler en het daarbij behorende standaard amplificatieprotocol. De ontworpen routinetest was gebaseerd op amplificatie van een in verschillende kopieën voorkomend (2kb repeated) gen. In de praktijk was de test uitvoerbaar in één werkdag.

Evaluatie van de T. vaginalis PCR
In de evaluatiefase van de nieuwe T. vaginalis PCR werd op monsters, waarvan de PCR-uitslag niet overeenkwam met die van preparaat + kweek, een extra confirmatie-PCR uitgevoerd, nu gericht op het T. vaginalis ß-tubuline gen. Daarbij werd er vanuit gegaan, dat een monster écht T. vaginalis bevatte (dus ‘true-positive’ was) als de kweek positief was en/of zowel de routine-PCR (2 kb repeated gen) als de confirmatie-PCR (tubuline gen) positief was.

Resultaten en discussie
Van de 2.069 monsters waren er 40 positief met de PCR en 27 positief met preparaat/kweek. Geen enkel monster was negatief met de PCR maar positief met preparaat/kweek. Daarentegen waren 13 monsters positief met de PCR en negatief met preparaat/kweek.
Voor 11 van deze discordante monsters kon de PCR-uitslag bevestigd worden met de confirmatie-PCR op het ß-tubuline gen. De twee niet bevestigde PCR-positieven waren slechts zwak-positief. Dat maakte het ook moeilijker om ze te bevestigen met de gebruikte - ietwat minder gevoelige - confirmatietest. In totaal was dus bij 38 van de 2069 patiënten T. vaginalis aanwezig, wat neerkomt op een prevalentie van 1.8% (Tabel 1). Daarbij was de PCR significant gevoeliger dan preparaat/kweek (p < 0,01, Z-toets voor de vergelijking van verhoudingen6), terwijl de positief voorspellende waarde (minstens) 95% was (Tabel 2) . Remming van de PCR-test kwam vrijwel niet voor (slechts bij twee monsters = 0,1%).
Van de 38 T.vaginalis bevattende monsters waren er 37 afkomstig van vrouwen, en slechts één van een man. Derhalve was de prevalentie bij de onderzochte vrouwen 1,9% (37/1977), en 1,1% (1/92) bij de onderzochte mannen. Ter vergelijking: bij soa-consulten werd in Nederland in 2004 bij 9,6% patiënten C. trachomatis gevonden, bij 3,4% N. gonorrhoeae en bij 1,3% syfilis.7

Tabel 1 : Testresultaten

Tabel 2 : Testkarakteristieken  

Uit de 2.069 onderzochte genitale monsters werden ondermeer ook de volgende andere micro-organismen gekweekt: Candida species, C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, C. freundii, E. cloacae, E. coli, G. vaginalis, H. influenzae, H. parainfluenzae, alpha-haemolytische Streptococcus, S. aureus, S. group A, B en G, S. milleri en S. pneumoniae. Al deze monsters waren negatief met de T. vaginalis PCR. Hetzelfde gold voor monsters waarin (met PCR) C. trachomatis of N. gonorrhoeae werd aangetoond. Ook hieruit bleek dus de grote specificiteit van de ontworpen T. vaginalis PCR.

Vervolgonderzoek (controletest na behandeling)
Zoals gebruikelijk bestond de behandeling van de T. vaginalis positieve patiënten uit één dosis van 2g metronidazol. Bij negen van de vrouwelijke patiënten werd twee weken na het begin van de behandeling nogmaals een uitstrijk afgenomen en getest met de T. vaginalis PCR. Zeven daarvan bleken toen T. vaginalis PCR negatief te zijn. Bij de andere twee, nog PCR-positieve, patiënten bestond er twijfel over de therapietrouw. Beiden werden met tussenpozen van steeds 2-4 weken opnieuw getest. Eén van de twee patiënten werd na ongeveer drie maanden T. vaginalis PCR-negatief, de andere werd vervolgens pas een jaar later opnieuw getest en was toen negatief.
Een voorzichtige conclusie uit dit vervolgonderzoek is dat T. vaginalis DNA na behandeling niét zeer lange tijd aanwezig blijft en dus ook niet op die manier foutpositieve uitslagen zal kunnen veroorzaken.

Onderzoek op urinemonsters
In het verleden is al verschillende malen beschreven dat een klassieke (niet real-time) T. vaginalis PCR ook heel goed op urine monsters – in plaats van uitstrijken - uitgevoerd kan worden.3,8,9 Bij wijze van steekproef is onze T. vaginalis real-time PCR ook uitgeprobeerd op zeven urine monsters die, vlak voor het begin van de behandeling, verkregen waren van T. vaginalis PCR-positieve vrouwelijke patiënten. Alle zeven urinemonsters waren T. vaginalis PCR-positief. Ofschoon het aantal hierbij geteste monsters te gering was voor een definitieve uitspraak, lijken de resultaten inderdaad te bevestigen dat T. vaginalis PCR ook goed uitvoerbaar is op urines. Dat kan een groot voordeel zijn, zeker bij het testen van mannen.

Onderzoek in het kader van sos-aanvragen (klinisch geen verdenking op T. vaginalis)
Náást de bovenbeschreven studie werd de T. vaginalis PCR ook nog uitgevoerd op 1.322 extra monsters van patiënten (785 ♀, 537 ♂), die alléén maar ingestuurd waren voor diagnostiek op C. trachomatis of N. gonorrhoeae, zónder specifieke verdenking op een infectie met T. vaginalis (en daarop dus ook niet gekweekt werden). In deze monsters was de prevalentie bij vrouwen toch nog 1.0%, en bij mannen slechts 0,2%.

Conclusies:
De T. vaginalis PCR is véél gevoeliger dan de klassieke detectiemethoden (direct preparaat en kweek). Weliswaar kan men ervoor kiezen eerst snel een direct preparaat te maken en te beoordelen, maar bij een negatief direct preparaat – dus vrijwel altijd – zal daarna een PCR (in plaats van een kweek) uitgevoerd moeten worden. Doordat de PCR véél minder bewerkelijk is dan de klassieke methoden kan de test uitgevoerd worden voor een vergelijkbare prijs.
Volgens de literatuur is naar schatting 10-50% van de T. vaginalis-infecties bij vrouwen asymptomatisch.10,11 Zeker bij vrouwen lijkt er veelal dus sprake te zijn van onderdiagnostiek. Of dat klinisch relevant is bij asymptomatische vrouwen (of mannen), is de vraag.
De indicaties voor laboratoriumonderzoek op T. vaginalis blijven vooral fluor vaginalis-klachten bij vrouwen en onbegrepen non-specifieke urethritis bij mannen. Daarnaast zou overwogen kunnen worden ook vrouwen zonder speciale verdenking op een infectie met T. vaginalis - maar ingestuurd voor standaard soa-onderzoek – te testen met de T. vaginalis- PCR. Dat zal zéker méér diagnoses opleveren en mogelijk ook de verdere verspreiding van T. vaginalis helpen voorkomen. Er is echter geen kosteneffectiviteitanalyse van deze benadering beschikbaar. Het PCR onderzoek op T. vaginalis kan gecombineerd worden met het PCR-onderzoek op C. trachomatis en/of N. gonorrhoeae. Het is dus niet nodig voor de PCR op T. vaginalis apart materiaal op te sturen.

Redactioneel commentaar: Trichomonas-diagnostiek anno 2005

Referenties

1. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections. Trichomoniasis estimates 1999. World Health Organization, 2001. www.who.int/docstore/hiv/GRSTI/006.htm.
2. Madico G, Quinn TC, Rompalo A, et al. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples. J Clin Microbiol 1998; 36: 3205-10.
3. Van der Schee C, van Belkum A, Zwijgers L, et al. Improved diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swabs and urine specimens compared to diagnosis by wet mount microscopy, culture, and fluorescent staining. J Clin Microbiol 1999; 37: 4127-30.
4. Wendel KA, Erbelding EJ, Gaydos CA, Rompalo AM. Trichomonas vaginalis polymerase chain reaction compared with standard diagnostic and therapeutic protocols for detection and treatment of vaginal trichomoniasis. Clin Infect Dis 2002; 35: 576-80.
5. CBO Richtlijn Seksueel Overdraagbare Aandoeningen en Herpes Neonatorum, Kwaliteitsinstituut voor de Gezondheidszorg, 2002.
6. Moore DS, McCabe A. Introduction to the practices of statistics, 2nd Ed. Freeman, New York, 1993.
7. Van der Laar MJW. SOA nemen opnieuw toe. Voorlopige cijfers 2004. Infectieziekten Bulletin, 2005; 4: 116-17.
8. Schwebke JR, Lawing LF. Improved detection by DNA amplification of Trichomonas vaginalis in males. J Clin Microbiol 2002; 40: 3681-3.
9. Wendel KA, Erbelding EJ, Gaydos CA, Rompalo AM. Use of urine polymerase chain reaction to define the prevalence and clinical presentation of Trichomonas vaginalis in men attending an STD clinic. Sex Transm Infect 2003; 79: 151-3.
10. Burstein GR, Zenilman JM. Nongonococcal urethritis--a new paradigm. Clin Infect Dis 1999; 28, Suppl 1: S66-73.
11. Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th Edition, p 2895. Editors: G.L.Mandell, J.E. Bennett en R.D. Dolin. Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000.